---zastosowanie-na-czym-polega-technika-pcr.jpg)
PCR je test, který se používá při diagnostice mnoha nemocí. Metoda PCR umožňuje ukázat přímou přítomnost bakterií v organismu, konkrétně jeho DNA. Používá se mimo jiné testování PCR v diagnostice lymské boreliózy. Co je technika PCR? Co je to PCR v reálném čase?
Obsah:
- PCR (testování) - jaká je technika PCR?
- PCR (výzkum) - aplikace metody PCR
- PCR (výzkum) - borelióza
- PCR (výzkum) - výsledky. Mohou to být falešně pozitivní výsledky?
- PCR (výzkum) - výsledky. Mohou být falešně negativní
PCR (polymerázová řetězová reakce) je základní metodou používanou v genetických a molekulárních laboratořích. Byl vyvinut v roce 1983 Karou Mullisovou, která za něj v roce 1993 získala Nobelovu cenu.
Poslechněte si, o čem je technika PCR. Toto je materiál z cyklu LISTENING GOOD. Podcasty s tipy.
Chcete-li zobrazit toto video, povolte JavaScript a zvažte upgrade na webový prohlížeč, který podporuje video
PCR (testování) - jaká je technika PCR?
Testování PCR spočívá v mnohonásobné amplifikaci (obvykle v 30-40 cyklech) specifického fragmentu DNA, např. Genů kódujících proteiny Borrelia, s použitím polymerázového enzymu.
Poté se ke zviditelnění fragmentu amplifikované DNA použijí speciální molekulární barviva. PCR, díky amplifikaci specifických fragmentů DNA, je ultracitlivá metoda.
V metodě PCR jsou fragmenty DNA amplifikovány pomocí specifických párů primerů pro danou oblast bakteriální DNA. Například cílové oblasti v PCR používané při diagnostice lymské boreliózy jsou geny kódující proteiny, např. 16S rDNA, recA, fla, p66, OspA.
Biologický materiál, ze kterého lze provést zkoušku, je:
- krev
- část kůže z migrujícího erytému
- mozkomíšní mok
- synoviální tekutina nebo z kloubní chrupavky
- moč
PCR (výzkum) - aplikace metody PCR
Kromě diagnostiky lymské boreliózy pomocí metody PCR je možné detekovat specifické fragmenty DNA jiných mikroorganismů nebo lidí. Proto se metoda PCR používá také v:
- diagnostika a sledování virových infekcí: herpesviry (herpes virus, herpes zoster, Epstein-Barr, cytomegalovirus), HIV, viry hepatitidy (HBV a HCV)
- diagnostika a sledování bakteriálních infekcí, zejména těch bakterií, které nelze identifikovat kultivací, např. tuberkulóza
- diagnostika a sledování neoplastických onemocnění: leukémie, rakovina prsu, kolorektální rakovina, rakovina plic
- diagnóza predispozice k rakovině: rakovina prsu a vaječníků (geny BRCA1 a BRCA2), kolorektální karcinom (geny APC a CHEK2)
- diagnostika genetických chorob: hemochromatóza (gen HFE), talasémie (geny HBA1 a HBA2), celiakie (geny HLA)
- testy otcovství, které detekují DNA kompatibilitu dítěte a otce
V současné době existuje mnoho modifikací metody PCR. Například v diagnostice Lyme choroby se používají hlavně metody nested PCR (nested PCR) a real-time PCR. Jedná se o kvantitativní metodu, která umožňuje určit přesný počet kopií DNA borelie v testovaném biologickém materiálu.
PCR (výzkum) a borelióza
Sérologické testy jsou základem pro diagnostiku lymské boreliózy. Existují však klinické situace, které mohou způsobit, že tyto testy budou falešně negativní:
- sérologické okno, tj. počáteční období infekce, ve kterém tělo ještě neprodukuje specifické protilátky IgM a IgG proti spirochetám Borrelia
- u lidí s imunodeficiencí, kteří neprodukují dostatek protilátek
- přítomnost imunitních komplexů, které se skládají z antigenů Borrelia a specifických protilátek proti nim, a brání detekci protilátek sérologickými metodami
Pokud jsou u pacienta podezření na příznaky lymské boreliózy a výsledky sérologických testů jsou negativní, lze provést molekulární testování založené na metodě PCR.
DNA spirochet Borrelia lze detekovat v rané fázi infekce, protože počet spirochet v tělních tekutinách je pak nejvyšší.
Při diagnostice lymské boreliózy se primárně používají sérologické metody, jako je ELISA, ale v některých klinických situacích jsou užitečné genetické testy využívající metodu PCR.
Čím delší je doba od infekce, tím menší je pravděpodobnost detekce bakteriální DNA. Proto se v některých případech před provedením testu PCR bakterie pěstují na speciálním médiu po dobu 1–2 týdnů a poté se test provede.
Tento přístup se používá v případě podezření na lymskou boreliózu a odebraný mozkomíšní mok. V pozdní fázi infekce je vhodnější provést test ELISA.
Metoda PCR by se neměla používat při rutinní diagnostice lymské boreliózy kvůli nedostatečné standardizaci týkající se výskytu odrůd Borrelia burgdorferi v Polsku.
V případě obtíží s diagnostikou (zejména v časném stadiu onemocnění) však výsledek testu PCR pomáhá v diagnostickém procesu.
Pozitivní výsledek testu znamená, že v testovaném materiálu byla detekována přítomnost DNA Borrelia burgdorferi a jejích odrůd, ale nevysvětluje, zda je tělo aktivně infikováno. Na druhé straně negativní výsledek nevylučuje přítomnost bakterií v těle.
Některé laboratoře nabízejí testování na přítomnost DNA Borrelia v klíště. Výsledek takového vyšetření však není základem pro diagnostiku lymské boreliózy u ukousnuté osoby.
Doporučený článek:
Test ELISA - co detekuje? Jak číst výsledky? Cena testuVýsledky PCR. Mohou to být falešně pozitivní výsledky?
PCR je velmi citlivá metoda a zároveň velmi citlivá na kontaminaci. Proto je v testech založených na PCR velmi důležité vybrat vhodnou interní kontrolu k vyloučení falešně pozitivních výsledků.
Klíčem je také správný sběr materiálu pro testování, jakož i zkušenosti a spolehlivost diagnostika provádějícího test.
Výsledky PCR. Mohou být falešně negativní
Jako v každém laboratorním testu, i v metodě PCR se mohou objevit falešně negativní výsledky. Zde je zásadní odebrat krev pro vhodné antikoagulant, protože některé z nich, jako je heparin, mohou inhibovat PCR reakci.
Sběr materiálu po zahájení antibiotické terapie může také způsobit snížení účinnosti PCR reakce a větší pravděpodobnost falešně negativních výsledků.
Mělo by se také pamatovat na to, že bakterie Borrelia žijí velmi krátce v krvi a tělesných tekutinách, protože díky speciálním receptorům velmi rychle pronikají na „těžko dostupná“ místa v těle.
Na rozdíl od diagnostiky jiných mikroorganismů je proto počet spirochet Borrelia v biologickém materiálu malý, někdy dokonce na hranici detekce metody PCR. To může také způsobit falešně negativní výsledek.
Doporučený článek:
Test transformace lymfocytů (LTT)Literatura
- Dunaj J. a kol. Význam metody PCR v diagnostice lymské boreliózy. Procházet Epidemiol. 2013, 67, 119 - 123.
- Laboratorní diagnostika chorob přenášených klíšťaty. Doporučení pracovní skupiny: Národní komora laboratorních diagnostiků, Národní ústav veřejného zdraví - Národní ústav hygieny, Národní konzultant v oblasti infekčních nemocí, Ústav infekčních nemocí a neuroinfekcí, Lékařská univerzita v Białystoku, Polská virologická společnost, Varšava 2014.
- Ružić-Sabljić E. a Cerar T. Pokrok v molekulární diagnostice lymské boreliózy. Expert Rev Mol Diagn. 2017 Jan; 17 (1): 19-30.
- Valones M.A.A. et al. Principy a aplikace polymerázové řetězové reakce v lékařských diagnostických oborech: přehled. Braz J Microbiol. 2009 Jan-Mar; 40 (1): 1-11.
---zastosowanie-na-czym-polega-technika-pcr_1.jpg)
---normy.jpg)
